TPL_BEEZ2_NAV_VIEW_SEARCH

TPL_BEEZ2_NAVIGATION

CheckLite CT 150

ID - № 1 002 652

Набор для быстрого определения общих колиформных бактерий

CheckLite CT 150 - набор для определения колиформных бактерий, В основе методики лежит высокочувствительное биолюминометрическое исследование на β-галактозидазу колиформных бактерий.
CheckLite CT 150 – более чувствительный метод определения, чем колориметрическое исследование.
CheckLite CT 150 – качественный тест (на присутствие или отсутствие колиформ), система не производит количественный подсчет бактерий.

Принцип измерения
CheckLite CT 150 ферментативный тест на присутствие общих колиформ, основанный на определении β-галактозидазы. Рекомендуемая среда содержит сурфактант, способствующий росту только Грам - –  бактерий. Реагент для определения «Detection reagent CT 150» содержит D- Люциферин- О - β-галактопиранозид (LuGal), производное соединение люциферазы и β-галактозидазы. Люциферин высвобождается из LuGal при взаимодействии с β-галактозидазой колиформных бактерий, вызывает реакцию сопровождающуюся образованием люциферазы и сопровождающуюся люминесценцией (свечением). Количество биолюминесценции производимое в данной реакции прямо пропорционально количеству β-галактозидазы в исследуемой культуре и отдельных клетках колиформных бактерий. Высокочувствительное биолюминометрическое исследование на β-галактозидазу является  более быстрым методом, чем колориметрическое исследования на колиформы.

Хранение набора
Набор хранится в холодильнике при 2-8 0С. Хранить восстановленный (в который уже добавлен растворитель) детекционный реагент при 2-8 0С, если он будет использован в течение дня, и ниже – 20 0С, если будет использоваться в течение недели. Когда используется восстановленный и сохраняемый реагент, проверьте Уровень 1 и Уровень 2 (см. Приготовление реагента).

Состав набора
А. Реагент для определения, детекции колиформ «Detection reagent CT 150»:
5 пузырьков с зеленой этикеткой (содержит D- Люциферин - О - β-галактопиранозид, рекомбинант люциферазы светлячков и АТФ в лиофилизированной форме)
Б. Вода – растворитель «Solvent water CT 150»:
5 пузырьков розового цвета по 6,3 мл – содержит ультра чистую воду для растворения реагента для определения «Detection reagent CT 150»
В. Реагент для лизиса бактериальных клеток «Permeabilizer CT 150»
5 мл х 2 пузырька фиолетового цвета – содержит сурфактант (5% бензалкониум хлорид) для отделения колиформных клеток друг от друга.
Д. Позитивный контроль «Positive Control CT 150»:
1 пузырек голубого цвета на 2 мл – содержит β-галактозидазу E. Coli 

Приготовление реагентов

Приблизительно за час до окончания стадии селективного обогащения, необходимо приготовить детекционный реагент. Необходимо приготовить достаточное количество реагента, чтобы была возможность исполнить в двое большее количество исследований, чем количество образцов (один - контрольный для проверки работы собственно самого реагента). Один пузырек содержит количество реагента, достаточное для проведения 30 исследований, т.е.  на 28 реально  исследуемых образцов.
1 Растворение: Чистая вода – растворитель «Solvent water CT 150» из розового пузырька заливается в зеленый пузырек  - реагент для определения «Detection reagent CT 150». Помешивайте пузырек аккуратно, чтобы не образовывались комочки. Перемешивайте до полного растворения «Detection reagent CT 150».
2 Перемешивание: Если вы растворяете более чем один пузырек, то перемешивайте  реагенты в чистой тубе или бутылке (чтобы исключить возможность контаминации бактериями, содержащими β-галактозидазу). Если в первом контрольном измерении (пробирка №1) (см. пункт 4 Б) определяется уровень, более чем 800 RLU, то туба или бутылка могут быть контаминированны.
3 Перенос: Приготовить в два раза больше ЛюмиТуб, чем тестируемых образцов. Добавить 200 мкл детекционного реагента «Detection reagent CT 150» в каждую тубу. Затем инкубировать от 30 мин до 1 часа при комнатной температуре (20 -300С) (люминесценция стабильная в этот период).
4 Проверка:
А) Протрите вокруг крышки камеры люминометра 70-80% раствором спирта, чтобы удалить микрочастицы люциферина, которые могли распылиться во время предыдущего исследования.
Б) Измерьте количество биолюминесценции (в RLU – относительных световых единицах) в инкубированной тубе (значение №1) на люминометре.
В) Выньте новую тубу (значение №2)  и добавьте 40 мкл позитивного контроля «Positive Control CT 150» - пузырек голубого цвета и оставьте его на 5 – 30 мин (люминесценция стабильная в этот период).
Г) Измерьте RLU в другой тубе (значение №2). Проверьте, измерение считается правильным, если уровень RLU в  тубе (значение №2) по крайней мере в 20 раз выше чем в тубе (значение №1). Если нет, то вполне возможно произошла контаминация β-галактозидазой или реагент не работает. Приготовьте новый реагент и проверьте снова.

Требуемое оборудование и материалы
1 Среды для селективного обогащения: СТ Medium (0,55% Nutrient broth №2 (Oxoid), 0,078% Triptone (Difco.), 0,39% NaCl, mM IPTG, pH 7,3), XM Broth (Elmex, Tokio) или XM - 50 (Elmex, Tokio)
2 Люминометр Lumitester C -100 (Scil Diagnostics)
3 LumiTube (Scil Diagnostics)
4 Подставка для туб
5 Инкубатор
6 20-100 мкл
7 Перчатки
8 Спирт 70-80%
9 Автоклав

Отбор образцов и приготовление
Пре - инкубация  тестируемой среды:
До проведения теста необходимо пре – инкубировать   тестируемую среду при 37 0С (обычно берут большее количество среды, чем количество исследуемых образцов).
Техника отбора проб:
А) Сваб тест:
Смочить сваб в стерильном физ. Растворе. Протереть свабом руки, стеклянную посуду или другие  поверхности. Осторожно, не контаминируйте сваб до момента использования. Погрузите сваб в 2 мл СТ среды или ХМ бульона и перенесите попавшие на сваб микроорганизмы в среду. Когда протираете сильно загрязненную поверхность, то погрузите сваб в буфер и (1 -10 мл) и используйте кратный объем (0,1 мл) для селективного обогащения.
Держите оставшиеся образцы в холодильнике для измерения пустой пробы (бланк измерения)
 Б) Пищевая и молочная продукция:
Исследуются жидкие образцы, если образец твердый, то производится экстракция, с использованием буфера, в основном фосфатный буфер. Оставшийся исследуемый образец или экстракт необходимо содержать в холодильнике для измерения пустой пробы (бланк измерения)
Не приготовленная пища иногда может содержать значительное количество β-галактозидазы, которая увеличивает значение пустой пробы (бланк измерения)  и делает исследование менее чувствительным. Количество среды, в которое инокулируется исследуемый образец должно быть в 10 раз больше (соотношение 1:10).
С) Исследование воды:
Растворить 50 мл исследуемой воды в 500 мл XM – 50.

Стадия селективного обогащения:
Инкубировать тестируемую среду при 370С в течение 5 часов (можно до 24 часов) без перемешивания. Определенное время инкубации указанно в таблице №1. Не забывайте инкубировать среду, которая не инокулированна, вместе с образцами для измерения пустой пробы (бланк измерения)

Колиформы

Время инкубации

Eschrichia coli IAM12119

5 часов

Citrobacter freundii JCM1657

7 часов

Enterobacter cloacae IAM12349

6 часов

*Исходно тестируется 10 КОЕ в 2 мл исследуемой среды

Процедура проведения исследования

1 Лизис  клеток: Добавить 40 мкл реагента для лизиса бактериальных клеток «Permeabilizer CT 150» к 2 мл исследуемого образца, и аккуратно перемешать. В случаях, когда используется большее количество образца, то необходимо исходить из соотношения 1/50 (реагент/образец). Раствор обычно становится белого цвета и мутным. (После данной процедуры образец становится стерильным, но будьте осторожны, не пролейте образец до добавки данного реагента).
2 Добавить тест образец в реагент в течение одной минуты после лизиса клеток (не позднее) (иначе β-галактозидаза выделенная из колиформных клеток может быть инактивированна) Добавляется 40 мл тестируемого образца в ЛюмиТубу, где содержится 0,2 мл детекционного реагента. Если у вас много тестируемых образцов, то повторите операцию снова. Необходимо оставить тестируемый образец на 10-30 мин при комнатной температуре. Люминесцентная активность образца остается стабильной (сохраняться) в течение 30 минут при комнатной температуре.
3 Производится измерение исследуемого образца на приборе Люминометр Lumitester C -100 (количество RLU).
4 Измерение пустой пробы (бланк измерение): Взять не инокулированную тест среду и исполнить операции с 1 по 3 (согласно процедуре проведения исследования) таким же образом (Значение №3). Если образцы были взяты с сильно загрязненной поверхности, на пищевом или молочном предприятии, то необходимо использовать смесь образцов или экстракты, взятые из холодильника и инкубировать среду в таком же  соотношении, как и для исследуемых образцов со средой обогащения вместо только одной среды. Измерение №3, которое является бланк измерением (пустой пробой), является очень важным для интерпретации результатов. Если Измерение №3 превышает 3000 RLU, это означает, что образец содержит значительное количество β-галактозидазы, которое делает исследование менее чувствительным.

Интерпретация результатов
Тест образец считается положительным (наличие колиформ), когда полученное измерение с исследуемого образца выше чем в 2 раза бланк измерения (Измерения №3). Если измерение с исследуемого образца в 1,5 раза больше, но меньше, чем в 2 раза, образец может быть колиформ позитивным. В таких случаях рекомендуется тестировать образец с более длительным временем селективного обогащения (обычно образец, выдержанный в селективной среде на 1-2 часа больше, может прояснить результат). Если результат меньше чем в 1,5 раза, то результат считается негативным (отсутствие колиформ).

Внимание
Набор CheckLite CT 150 не рекомендуется использовать для диагностики заболеваний людей и животных. Набор создан для использования, близко с соответствующей асептической техникой для изоляции и идентификации микроорганизмов. Не допускать попадания реагентов набора на кожу и в глаза. В случае попадания в глаза или на кожу  немедленно смыть водой и обратиться к врачу.
Хранить в месте, специально предназначенном для реагентов, защищенном от контакта с детьми. Не допускать  контаминации реагентами и исследуемыми образцами пищи или пищевой продукции. 



Информация в формате pdf